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AS MICOTOXINAS


(http://www.fao.org/WAIRDOCS/X5012O/X5012o01.htm) As micotoxinas são compostos químicos venenosos produzidos por certos fungos. Há muitos desses compostos, mas apenas alguns deles são regularmente encontrados em alimentos e rações animais, como grãos e sementes. Entretanto, aqueles que realmente são encontrados em alimentos têm grande importância para a saúde do ser humano. As informações sobre micotoxinas relacionadas com alimentos são ainda multo incompletas, mas há conhecimento bastante para identificá-las como um problema grave em muitas partes do mundo.

Introdução

(Livro Microbiologia de Alimentos – página 633) Um grande número de fungos produz substâncias tóxicas conhecidas como micotoxinas. Algumas dessas substâncias possuem capacidade mutagênica e carcinogênica, enquanto outras apresentam toxicidade específica a um órgão ou são tóxicas por outros mecanismos.

Mesmo que a verdadeira toxicidade de muitas micotoxinas ainda não tenha sido demonstrada para humanos, o efeito desses compostos em animais de laboratório e em ensaios in vitro deixa poucas dúvidas a respeito de sua toxicidade potencial. No mínimo, 14 micotoxinas são carcinogênicas, sendo as aflatoxinas as mais potentes. Como regra, aceita-se que 93% dos compostos mutagênicos são carcinogênicos. Com as micotoxinas, ensaios microbiológicos revelaram um nível de 85% de correlação entre carcinogenicidade e mutagenicidade.

As micotoxinas são produzidas como metabólitos secundários. Os metabólitos primários dos fungos, como os de outros organismos, são aqueles essenciais ao crescimento. Já os secundários são formados durante o final da fase exponencial de crescimento e não possuem significância aparente para o crescimento ou metabolismo do organismo produtor. Em geral, esses metabólitos são formados quando grandes quantidades de precursores de metabólitos primários, tais como aminoácidos, acetato, piruvato e outros, são acumulados.

A síntese de micotoxinas representa uma maneira dos fungos reduzirem a quantidade de precursores, os quais não são requeridos para o metabolismo.

(http://www.microbiologia.vet.br/micotoxinas.htm) A história das micotoxinas começa em 1960, quando um surto de mortes inexplicáveis de aves no Reino Unido (especialmente perus) foi investigado. O surto ficou mundialmente conhecido como turkey X disease. Chegou-se à conclusão que o problema estava na ração, que havia sido feita com amendoim contaminado com uma substância fluorescente produzida pelo fungo Aspergillus flavus. Da expressão inglesa A. flavus toxin derivou a palavra aflatoxina. Hoje se sabe que não existe uma aflatoxina, mas pelo menos 17 compostos tóxicos, dentre os quais os mais importantes são as aflatoxinas B1, G1, B2 e G2. E destas, a aflatoxina B1 (AFB1) é considerada o agente natural mais carcinogênico que se conhece. Por conta disso e pela prevalência deste fungo (e de outras espécies produtoras), é a mais importante micotoxina no Brasil.

A partir de 1962, quando se estabeleceu as causas do surto, pesquisas subsequentes encontraram outros fungos produtores de substâncias tóxicas diferentes. Uma visão geral das mais importantes micotoxinas pode ser vista na Tabela 1.

TABELA 1 - PRINCIPAIS MICOTOXINAS COM SEUS RESPECTIVOS FUNGOS PRODUTORES, SUBSTRATOS E EFEITOS NO HOMEM E NOS ANIAMAIS ( VEJA NO PDF ABAIXO )

Os piores efeitos das micotoxinas no homem tendem a ser os crônicos, de difícil associação com o consumo de alimentos contaminados. Os principais efeitos registrados são indução de câncer, lesão renal e depressão do sistema imune.

(http://www.embrapa.br/imprensa/artigos/2005/artigo.2005-06-14.3711997257) O homem pode ser contaminado por micotoxinas através do consumo de alimentos processados ou in natura. Também pode ingerir carne de animais alimentados com ração contaminada, pois a toxina pode ser transmitida pelo corpo do animal através de sua carne, leite ou ovos. Alguns alimentos com contaminação potencial, como o milho, podem ter seus produtos derivados, como o óleo refinado, isento da toxina, pois há a destruição da mesma no processo de transformação do produto.

A legislação brasileira, através da resolução RDC Nº 274, do Ministério da Saúde, datada de 15/10/2002, dispõe que alguns alimentos para o consumo humano, como o amendoim, o milho em grão e o leite, podem ter uma concentração máxima de 0,5ng/kg) de aflatoxina, enquanto que a União Européia permite teores de aflatoxina mais restritos para alguns alimentos comuns à nossa legislação, variando de 2 a 5ng/kg. Já a Instrução Normativa nº13 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) de 27/05/2004, dispõe que se houver algum lote de mercadoria devolvida por importadores, ou por resultado de inspeção ou fiscalização, este poderá ser liberado para o consumo humano ou animal se o resultado da primeira análise for igual ou menor que o limite de 30 e 50 ng/kg.

As principais micotoxinas

(http://www.ensilagem.com.br/index.php?pag=noticia&id_noticia=49&id_menu=27&title_dinamic=Micotoxinas:%20um%20perigo%20invis%EDvel)

Existe um grande numero de fungos capazes de produzir toxinas. Na literatura são descritas mais de 400 tipos de micotoxinas.

As micotoxinas são diferentes quimicamente, com representantes em várias famílias e com um peso molecular que varia de 200 a 500 kD. Existem centenas de micotoxinas conhecidas, mais poucas foram extensivamente estudadas.

A seguir são descritas as principais micotoxinas relacionadas à alimentos.

Aflatoxina

(Livro Microbiologia de Alimentos – página 633) As aflatoxinas são as micotoxinas mais amplamente estudadas. São conhecidas desde 1960, quando mais de 100 mil perus morreram na Inglaterra após ingerirem ração contendo amendoim importado da África e da América do Sul. A partir da ração que causou a morte dos animais, foram isolados Aspergillus flavus e uma toxina produzida por esse fungo, a qual foi designada aflatoxina (toxina do Aspergillus flavus - A-flatoxina). Estudos sobre a natureza dessas substâncias tóxicas revelaram quatro componentes, os quais são apresentados na Figura 1.

FIGURA 1 - ESTRUTURA DAS AFLATOXINAS (PDF – página 12)

Posteriormente, também foi verificado que A. parasiticus, A. nominus e outras espécies de Aspergillus produzem aflatoxinas. Quimicamente, as aflatoxinas são cumarinas altamente substituídas e, no mínimo, 18 toxinas intimamente relacionadas são conhecidas. A aflatoxina B1 (AFB1) é produzida por todas as linhagens produtoras de aflatoxinas, sendo a micotoxina mais potente dentro desse grupo. A AFM1 é um produto hidroxilado da AFB1, e aparece no leite, urina e fezes de animais como um produto metabólico. Outros derivados da AFB1 são a AFL, AFLH1, AFQ1 e AFP1. A AFB2 é a forma 2,3-dihidro da AFB1, enquanto que a AFG2 é a forma 2,3-dihidro da AFG1. A toxicidade das seis aflatoxinas mais potentes decresce na seguinte ordem: B1 > M1 > G1 > B2 > M2 ≠ G2. Quando observadas sob luz ultravioleta (UV), as micotoxinas B1 e B2 fluorescem na cor azul, as micotoxinas G1 e G2 na cor verde e verde-azulada, respectivamente, e as micotoxinas M1 e M2 na coloração azul-violeta e violeta, respectivamente.

As micotoxinas são metabólitos secundários poliquetídeos, cuja estrutura carbônica é proveniente do acetato e do malonato. A rota metabólica parcial proposta para a síntese de AFB1 é: acetato > ácido norsolorínico > averantina > averufanina > averufina > versiconal hemiacetal acetato > versicolorina A > esterigmatocistina > O-metilesterigmatocistina > AFB1. O composto versicolorina A é o primeiro na rota que contém a dupla ligação essencial C2-C3.

De modo geral, os parâmetros mínimos e máximos que controlam o crescimento fúngico e a produção de micotoxinas não são fáceis de definir. Esse fato ocorre, em parte, devido à diversidade de ambientes que os fungos habitam na natureza e, também, por serem organismos eucarióticos propriamente ditos. Assim, fica claro que o crescimento pode ocorrer sem a produção de toxina.

A AFG1 é produzida em temperaturas mais baixas de crescimento do que a AFB1. Alguns pesquisadores têm encontrado maior produção de AFB1 do que AFG1 em temperaturas próximas a 300C, enquanto outros têm observado produções equivalentes. Com relação a A. flavus e A. parasiticus, o primeiro geralmente produz somente AFB e AFG.

A aeração favorece a produção de aflatoxinas, e a quantidade de 2mg/g pode ser produzida em substratos naturais, como arroz, milho, soja e outros semelhantes. Em meios de cultura em caldo contendo níveis apropriados de Zn2+, podem ser produzidos até 200 ou 300mg/L de toxina.

Em alimentos, as aflatoxinas tem sido encontradas em carne fresca, presunto e bacon, inoculados com culturas toxigênicas e estocados a 150C, 200C e 300C.

As aflatoxinas também têm sido encontradas em uma ampla variedade de alimentos, incluindo leite, cerveja, chocolate, uva passa, produtos à base de soja, entre outros. Em linguiças fermentadas a 250C, observou-se a produção de 160ppm e 426ppm de AFG, em um período de 10 e 18 dias, respectivamente, sendo a produção de AFG1 dez vezes superior a de AFB1. As aflatoxinas têm sido produzidas em pães integrais de trigo e centeio, em queijos Tilsit e em suco de maçã a 220C. Essas micotoxinas tem sido observadas na camada superior de queijo cheddar, com três meses de maturação, mantido em temperatura ambiente. Em queijo Brick, a 12,80C, foram produzidas A. parasiticus após uma semana, mas não A. flavus. A AFB1 foi encontrada em três de 63 amostras comerciais de manteiga de amendoim, em níveis inferiores a 5ppb.

A produção de aflatoxina tem sido demonstrada em um grande número de produtos alimentícios, além dos previamente citados. Sob condições ótimas de crescimento, algumas toxinas podem ser detectadas em 24 horas ou dentro de 4 a 10 dias. Em amendoins, algumas observações devem ser consideradas, tais como o crescimento de fungos e a produção de aflatoxinas ocorrem, em grande parte, durante o armazenamento após a colheita; em um lote de amendoim contaminado, relativamente poucas vagens contêm toxina, de modo que o sucesso na detecção depende da coleta de uma amostra relativamente grande (aproximadamente 1 kg), por análise; a quantidade de toxina irá variar grandemente mesmo em uma única vagem; e os dois fatores mais importantes que afetam a produção de aflatoxina são a umidade e a temperatura.

A FDA estabelece como permitidos os seguintes níveis de aflatoxinas para alimentos: 0,5 ppb em leite e 20ppb para alimentos, rações, nozes brasileiras, amendoins, produtos derivados de amendoim e pistaches. O Codex Alimentarius recomenda que sejam seguidos os seguintes níveis máximos de micotoxinas para produtos específicos: 15µg/kg de aflatoxinas em amendoins para processamento, 0,05µg/kg de aflatoxina M1 em leite, 50µg/kg de patulina em suco de maçã e suco de maçã utilizado como ingrediente para outras bebidas, e 5µg/kg de ocratoxina em cereais e produtos de cereais.

Para a expressão de mutagenicidade, sistemas metabólicos de mamíferos são essenciais para o estudo das aflatoxinas, especialmente da AFB1. Também é essencial sua ligação com ácidos nucléicos, especialmente DNA. Apesar do DNA nuclear ser normalmente afetado, tem sido demonstrado que a AFB1 liga-se covalentemente ao DNA mitocondrial de células do fígado, preferencialmente ao DNA nuclear. Macromoléculas celulares que não sejam ácidos nucléicos são possíveis locais de ligação para aflatoxinas. Na molécula de aflatoxina, a dupla ligação entre C2-C3 na estrutura de hidrofurofurano é o local responsável pela mutagenicidade. A redução da AFB1 para a forma 2,3-dihidro (AFB2) diminui a mutagenicidade em 200 a 500 vezes. Depois da ligação ao DNA, as aflatoxinas induzem mutações pontuais, que são consideradas lesões genéticas predominantes, apesar de serem observadas também mutações que alteram a leitura do DNA. A mutagênese da AFB1 tem sido duas vezes maior na presença de butilhidroxianisol (BHA) e butilhidroxitolueno (BHT) e menos influenciada na presença de galato de propila, quando esses compostos são empregados no teste de Ames (ensaio biológico para avaliar a mutagenicidade potencial dos compostos químicos. Um teste positivo indica que o produto químico pode agir como uma substância cancerígena. O procedimento é descrito em uma série de documentos desde o início dos anos de 1970 por Bruce Ames e sua equipe na Universidade da Califórnia, Berkeley). Porém, ainda se desconhece se o aumento da toxicidade ocorre em sistemas animais.

Em pesquisas, a maioria das espécies animais susceptíveis morreu três dias após a administração das toxinas e apresentou grandes danos ao fígado, o qual, após exame post-mortem, revelou a capacidade hetapocarcinogênica da aflatoxina. A toxicidade foi maior em animais jovens e machos do que em animais mais velhos e fêmeas. Além disso, os efeitos tóxicos foram aumentados por dietas pobres em proteínas ou que prejudicavam o fígado.

Evidências circunstanciais sugerem que as aflatoxinas são carcinogênicas para humanos. Entre as consequências que se acredita serem devidas às aflatoxinas, pode-se citar a síndrome EFDV da Tailândia, a síndrome da Revê da Tailândia e Nova Zelândia e hepatomas (carcinomas hepatocelulares) agudos em crianças na Uganda. Por outro lado, tem sido notado que nenhuma micotoxina está relacionada a um tipo de câncer específico em humanos na ausência de infecção crônica com vírus da hepatite B.

Embora algumas micotoxinas sejam extremamente tóxicas para animais jovens de muitas espécies, acredita-se que sua toxicidade para humanos seja exagerada.

A AFB1 e a AFB2 podem ser reduzidas no milho pelo bissulfito. Figos secos contaminados com 250 ppb de AFB e submetidos a diversos tratamentos, 1% de bissulfito de sódio foi capaz de reduzir 28,2%, em 72 horas. Com 0,2% de H2O2 (adicionado 10 minutos antes do bissulfito de sódio) houve uma redução de 65,5%. Os aquecimentos de 450C a 650C por uma hora alcançaram uma redução de 68,4%, enquanto a radiação ultravioleta (UV) resultou em 45,7% de redução. Sementes de algodão contaminadas com aflatoxinas, tratadas com amônia e utilizadas como ração para vacas diminuíram os níveis de AFB1 e AFM1 no leite. Quando milho naturalmente contaminado com 1.600 ppm de aflatoxina foi tratado com 3% de NaOH a 1000C por 4 minutos, e posteriormente processado e frito, 99% da aflatoxina foi destruída.

Citrinina

A citrinina, cuja estrutura é apresentada na Figura 2, é produzida por Penicillium citrinum, P. viridicatum e outros fungos.Essa micotoxina tem sido detectada em arroz polido, pão mofado, presunto curado, trigo, aveia, centeio e outros produtos similares. Sob luz ultravioleta de comprimento longo, a citrinina fluoresce amarelo-limão.

FIGURA 2 - ESTRUTURA DA CITRININA (PDF – página 20) ( VEJA ABAIXO NO PDF )

Essa micotoxina é conhecidamente carcinogênica. Em um estudo, a partir de presunto curado, foram isoladas sete linhagens de P. viridicatum. Quando o potencial toxigênico dessas linhagens foi avaliado, todas se apresentaram como produtoras de citrinina em caldo de batata glicosado e em presuntos curados, mantidos entra 200C e 300C, por 14 dias.

A citrinina foi identificada a partir de produtos alimentícios mofados e pode ser produzida em meio sintético, juntamente com outras micotoxinas.

Enquanto organismos produtores de citrinina são encontrados em sementes de cacau e café, essa micotoxina, assim como as outras, não é encontrada durante o desenvolvimento fúngico. A aparente razão é a inibição, pela cafeína, da produção de citrinina pelo P. citrinum. A inibição da produção de citrinina é parcialmente especifica, uma vez que somente uma pequena redução no crescimento fúngico é observada.

Ocratoxina

As ocratoxinas consistem em um grupo de, no mínimo, sete metabólitos secundários relacionados estruturalmente, dos quais a ocratoxina A (AO) é a mais conhecida e tóxica. A ocratoxina B (OB) é a forma desclorada da ocratoxina A e, assim como a ocratoxina C, pode não ocorrer naturalmente. A Figura 3 apresenta a estrutura ocratoxina.

FIGURA 3 – ESTRUTURA DA OCRATOXINA (PDF – página 24)

A ocratoxina A é produzida por um grande número de fungos encontrados durante a estocagem, incluindo A. ochraceus, A. alliaceus, A. ostianus, A. mellus, além de outras espécies de Aspergillus. Entre os fungos do gênero Penicillium que produzem ocratoxinas A estão P. viridicatum, P. cyclopium e P. variable.

A ocratoxina A tem sua produção máxima em 300C e em atividade de água (aw) de 0,95. Na produção de ocratoxina A por A. ochraceus a 300C, a mínima atividade de água é de 0,85.

Essa toxina, hepatotóxica e nefrotóxica, têm sido encontrada em milho, feijão seco, sementes de cacau, grãos de soja, cevada, frutas cítricas, castanhas do Brasil, tabaco mofado, presunto curado, amendoins, grãos de café e demais produtos similares.

Sob luz ultravioleta, a ocratoxina A fluoresce esverdeada, enquanto que a ocratoxina B emite fluorescência azul.

Duas linhagens de A. ochraceus isoladas de presunto curado produziram ocratoxina A e B em arroz, em pasta de amendoim sem gordura e em presuntos curados. De toda a toxina produzida, 2/3 penetraram 0,5 cm após 21 dias, permanecendo o outro 1/3 na região micelial. De seis linhagens de P. viridicatum isoladas de presunto curado, nenhuma produziu ocratoxina.

Em um estudo para avaliar a eficácia de quatro inibidores químicos diante do crescimento e produção de ocratoxina A por duas linhagens a pH 4,5, os resultados foram: sorbato de potássio > propionato de sódio > metilparabeno > bissulfato de sódio.

Como a maioria das micotoxinas, a ocratoxina A é termicamente estável. Em um estudo, a maior taxa de destruição alcançada pelo cozimento de sementes de fava foi de 20%; os pesquisadores concluíram que a ocratoxina A não pode ser destruída por procedimentos normais de cocção.

Patulina

A patulina é produzida por um grande número de fungos do gênero Penicillium, incluindo P. claviforme, P. expansum e P. patulum. Pode ainda ser produzida por alguns fungos do gênero Aspergillus (A. clavatus, A. terreus e outros), por Bissochlamys nívea e B. fulva.

As propriedades biológicas da patulina se assemelham às do ácido penicílico. Alguns fungos da patulina podem produzi-la em temperaturas abaixo de 20C. Essa micotoxina tem sido encontrada em pães mofados, linguiças, frutas (incluindo bananas, pêras, abacaxis, uvas e pêssegos), suco de maçã, sidras e outros produtos. Em suco de maçã, níveis de até 440 µm/L têm sido verificados e, em sidras, níveis de 45 ppm já foram demonstrados.

Juntamente com a citrinina e a ocratoxina A, a patulina tem sido identificada a partir de produtos alimentícios mofados.

A atividade de água mínima para o crescimento de P. expansum e P. patulum tem sido relatada como de 0,83 e 0,81, respectivamente. Em caldo de batata glicosado incubada a 120C, a produção de patulina por P. patulum e P. roquefortii, após 10 dias de incubação, atinge níveis de até 1.033 ppm. A produção de patulina é favorecida por temperaturas abaixo da ótima para o crescimento dos fungos.

Estudos com P. expansum encontraram produção de patulina na faixa de 50C a -200C, com pequenas quantidades sendo produzidas a 300C. Atmosferas contendo CO2 e N2 reduzem a produção de patulina, quando comparadas às com ar. Para inibir a produção de patulina, o SO2 mostrou-se mais efetivo do que o sorbato de potássio ou o benzoato de sódio.

Tanto a patulina quanto o ácido penicílico ligam-se a grupos –SH e –NH, formando compostos ligados covalentemente, tendo suas toxicidades reduzidas. A patulina causa aberrações cromossomais em células animais e vegetais, além de ser carcinogênica.

A estrutura da patulina pode ser vista na Figura 4.

FIGURA 4 – ESTRUTURA DA PATULINA (PDF – página 21) ( VEJA ABAIXO NO PDF )

Ácido penicílico

O ácido penicílico, cuja estrutura é apresentada na Figura 5, tem propriedades biológicas similares às da patulina.

FIGURA 5 – ESTRUTURA DO ÁCIDO PENICÍLICO ( VEJA ABAIXO NO PDF )

É produzido por um grande número de fungos, incluindo os do gênero Penicillium (P. puberulum, por exemplo), assim como membros do grupo A. ochraceus. Um dos maiores produtores dessa toxina é o P. cyclopium. Essa micotoxina tem sido encontrada no milho, feijão e outros produtos agrícolas, além de ter sido produzida experimentalmente em queijo suíço.

É uma micotoxina comprovadamente carcinogênica.

Em um estudo, de 346 culturas de Penicillium isoladas de salame, cerca de 10% produziram ácido penicílico em meio de cultura líquido, porém cinco culturas que foram inoculadas em linguiça não produziram micotoxinas, mesmo após 70 dias. Em outro estudo, cerca de 183 fungos foram isolados de queijo suíço, sendo 87% do gênero Penicillium; destes, 93% cresceram a 50C. Dos extratos de Penicillium avaliados, 35% foram tóxicos a embriões de galinha, e de 5,5% foram recuperados tanto ácido penicílico como patulina e aflatoxinas. O ácido penicílico foi produzido a 50C, em seis semanas, por quatro de 33 linhagens fúngicas.

Esterigmatocistina

Essas micotoxinas são estruturalmente e biologicamente relacionadas às aflatoxinas e, como estas, possuem atividade hepatocarcinogênica em animais. No mínimo oito derivados são conhecidos. Entre os organismos que produzem esterigmatocistina, estão Aspergillus versicolor, A. nidulans, e A. rugulous. Sob luz ultravioleta, essa toxina fluoresce vermelho tijolo escuro.

Apesar de não ser frequentemente encontrada em produtos naturais, a esterigmatocistina tem sido observada em trigo, aveia, queijo holandês e grãos de café.

Embora esteja relaciona às aflatoxinas, a esterigmatocistina não é tão potente. Sua atuação ;é verificada pela inibição da síntese de DNA.

A estrutura da esterigmatocistina pode ser observada na Figura 6.

FIGURA 6 – ESTRUTURA DA ESTERIGMATOCISTINA (PDF – página 26) ( VEJA ABAIXO NO PDF )

Fumonisina

As fumonisinas são produzidas por fungos do gênero Fusarium em milho e em outros grãos. Algumas doenças humanas e animais estão associadas ao consumo de alimentos contaminados com altos níveis desses fungos. A estrutura da fumonisina pode ser vista na Figura 7.

FIGURA 7 – ESTRUTURA DA FUMONISINA (PDF – página 15) ( VEJA ABAIXO NO PDF )

As espécies produtoras de fumonisinas incluem F. anthophilum, F. dlamini, F. nygami, F. moniforme, e F.proliferatum. As últimas espécies citadas são produtoras de grandes quantidades de fumonisinas. A F. moniliforme (anteriormente F. verticillioides; Gibberella fujikurol) foi a primeira espécie associada com essas micotoxinas e é a mais estudada das três. A prevalência de F. moniliforma é significativamente maior em milho produzido em áreas onde ocorrem altas taxas de câncer de esôfago em humanos.

Existem, no mínimo, sete fuminosinas, sendo quatro do tipo B e, pelo menos, três do tipo A: FB1, FB2, FB3, FB4, FA1, FA2 e FA3. As principais são a FB1 e a FB3, sendo as outras consideradas secundárias. Das três toxinas principais, a FB1 (também designada macrofusina) é produzida em maiores quantidades por linhagens produtoras de fumonisinas. Por exemplo, entre nove linhagens de F. moniliforme, a produção de FB1 em milho autoclavado foi de 960 a 2.350µg/g. enquanto a de FB2 foi de 120 a 320 µg/g.

A fusarina C é produzida por F. moniliforme, mas aparentemente não esta envolvida em atividade hepatocarcinogênica. Essa micotoxina é mutagênica, mas somente após a ativação do fígado.

Com relação à temperatura e ao pH ótimos para crescimento, a máxima produção de FB1 por uma linhagem de F. moniliforme em cultura de milho foi obtida em 13 semanas, a 200C e com uma produção de 17,9g/kg em peso seco. Além disso, a maior taxa de crescimento fúngico ocorreu em 250C, sendo a fase estacionária alcançada no período de 4 a 6 semanas, na mesma temperatura.De modo geral, o tempo e a temperatura ótimos para produção de FB1 foram de sete semanas a 250C. Com relação ao crescimento de F. moniliforme, estudos têm demonstrado bons resultados em temperaturas de 250C a 300C, em uma faixa de pH de 3 a 9,5.

Conservantes, como o ácido benzóico, BHA e carvacrol, têm sido inibidores ou retardadores do crescimento micelial de inúmeras linhagens de Fusarium spp., sendo o acido benzóico o mais efetivo, seguido pelo carvacrol e pelo BHA.

A estrutura química da FB1 e da FB2 difere somente no carbono 10, onde a FB1 possui um grupo –OH em substituição ao –H presente na estrutura da FB2. Essas micotoxinas diferem das demais descritas anteriormente de duas formas: não possuem grupamentos cíclicos ou anéis em suas estruturas e são solúveis em água. Por outro lado, são estáveis em calor, como muitas outras micotoxinas.

Sambutoxina

A micotoxina conhecida como sambutoxina, cuja estrutura é apresentada na Figura 8, foi primeiramente reportada em 1994. Está associada com batatas secas e apodrecidas e é principalmente produzida por linhagens de Fusarium sambucinum e F. oxysporumi. De 13 espécies de Fusarium pesquisadas, cerca de 90% das linhagens pertencentes às duas espécies citadas produzem essa toxina.

Pesquisas realizadas com amostras de batatas apodrecidas provenientes da Coréia relataram que 9 de 21 amostras continham 15,8 a 78,1ng/g de sambutoxina, com uma média de 49,2ng/g. Utilizando substrato à base de trigo, níveis de 1,1 a 101,0µg/g de sambutoxina foram produzidas. A toxina foi encontrada em batatas provenientes de regiões do Irã que tinham alta incidência de câncer esofágico.

Segundo pesquisas realizadas com ratos, a sambutoxina causa hemorragia no estômago e intestino, sendo que os animais passam a rejeitar a ração e perdem peso.

Zearalenona

Existem cinco zearalenona de ocorrência natural, as quais são produzidas por Fusarium spp.,principalmente F. graminearum (anteriormente conhecido como F. roseum = Gibberella zeae) e F. Tricinctum. Associadas ao milho, esses organismos invadem a planta no estágio de floração, especialmente durante períodos chuvosos. Se os níveis de umidade permanecem suficientemente altos após a colheita, o fungo cresce e produz toxina. Outros grãos, como trigo, aveia, cevada e gergelim, podem ser infectados, além do milho.

A zearalenona fluoresce azul esverdeada sob luz ultravioleta de comprimento longo, e esverdeada sob luz ultravioleta de comprimento curto.

Essas micotoxinas possuem propriedades estrogências e promovem cio em camundongos e hiperestrogenismo em suínos. Não são mutagênicas e produzem uma resposta positiva com Bacillus subtilis.

A estrutura da zearalenona é apresentada na Figura 8.

FIGURA 8 – ESTRUTURA DA ZEARALENONA (PDF – página 19) ( VEJA ABAIXO NO PDF )

Prevenção e controle de toxinas

(http://www.fao.org/WAIRDOCS/X5012O/X5012o01.htm) Fungos não podem crescer (ou micotoxinas ser produzidas) em alimentos devidamente secos. Por isso, a secagem eficiente dos produtos e a sua conservação sem umidade é uma arma eficaz contra o crescimento de fungos e a produção de micotoxinas.

Para reduzir ou prevenir a produção da maioria das micotoxinas, o processo de secagem deve ser feito logo após a colheita e o mais rápido possível. A quantidade critica de água para o armazenamento seguro corresponde a atividade da água de cerca de 0,7. A manutenção de alimentos abaixo de 0,7 é uma técnica eficaz usada mundialmente para controlar estragos provocados por fungos e produção de micotoxinas em alimentos.

Problemas como a manutenção de atividade de água adequadamente baixa ocorrem frequentemente nos trópicos, onde a elevada umidade ambiental dificulta o controle da umidade do produto. Onde o grão é guardado em sacos, métodos que empregam cuidadoso sistema de secagem e, subsequente armazenamento em folhas de plástico a prova de umidade poderão superar este problema.

O modo correto de secagem é a melhor maneira de evitar o crescimento de fungos e a produção de micotoxinas em grãos após a colheita. Às vezes, quando a secagem ao sol não é possível ou fiável, é necessário usar alguma forma de secagem mecânica.

É possível controlar o crescimento de fungos em produtos armazenados através do controle ambiental ou do uso de preservativos ou inibidores naturais, mas tais técnicas são sempre mais dispendiosas do que uma secagem eficaz e, portanto, raramente viáveis em países em desenvolvimento.

O grão estragado tem mais tendência para invasão de fungos e, consequentemente, para contaminação de micotoxinas. Por isso, é importante evitar estrago antes e durante o processo de secagem, bem como no armazenamento. A secagem do milho na espiga, antes de descascar, é uma prática muito boa.

Os insetos são uma das principais causas de estrago; pragas de insetos de campo e algumas espécies de armazenamento estragam o grão e estimulam, em ambiente úmido, o crescimento de fungos no grão em amadurecimento. No armazenamento, muitas espécies de insetos atacam o grão, e a umidade que pode acumular oferece um meio ideal para os fungos. É essencial que o grão armazenado seja conservado livre de insetos, do contrário, são inevitáveis os problemas de umidade e mofo. Este se forma se faltar ao grão ventilação adequada e, particularmente, se forem usados contentares de metal.

Condições apropriadas de armazenamento também são de grande importância. Nas regiões tropicais, pode ser difícil manter secos os produtos durante o armazenamento, mas nunca é demais enfatizar a importância do armazenamento seco. Em pequena escala, embalagens de polietileno são eficazes; em larga escala, o armazenamento seguro requer estruturas bem desenhadas com pisos e paredes impermeáveis contra umidade. A manutenção da umidade do armazém abaixo de 70% é crucial.

Nas regiões tropicais, a umidade ao ar livre geralmente desce bem abaixo de 70% em dias ensolarados. A ventilação durante um período de tempo devidamente controlado, preferivelmente com ventilador, ajuda multo a manter a baixa umidade. O ideal é que as áreas de armazenamento de grande escala sejam equipadas com instrumentos de controle de umidade.

O armazenamento vedado em ambientes modificados para controle de insetos é também muito efetivo para controle do crescimento de fungos, desde que o grão seja devidamente seco antes do armazenamento e desde que sejam minimizadas as flutuações da temperatura diurna.

Se for necessário armazenar os produtos antes da adequada secagem, isto deve ser feito por um período curto, de no máximo, três dias. O uso de armazém vedado ou ambientes modificados prolonga este período de segurança, mas esses procedimentos são relativamente caros e em condições estanques.

É necessário um sistema comprovado de gestão de estoque que leve em consideração as micotoxinas como parte integral desse sistema. Já existe uma variedade de sistemas de apoio para a tomada de decisões que abrange vários níveis de sofisticação e escala.

(Livro Microbiologia de Alimentos – página 645) Além das considerações citadas acima, estudos sobre controle da produção de micotoxinas tem demonstrado que certos organismos, especialmente outros fungos, são eficientes no controle do crescimento de fungos toxigênicos e na inibição da produção de toxinas. Entre os primeiros estudos de desintoxicação de aflatoxinas, demonstrou-se que a bactéria Flavobacterium aurantiacum removeu aflatoxinas da solução em teste. Em estudos posteriores, demonstrou-se que essa bactéria, na verdade, degradava AFB1 em meios de cultura. Leveduras em crescimento demonstraram ser capazes de degradar patulina. Entre as bactérias lácticas, a Lactobacillus acidophilus apresentou-se como um eficiente inibidor do crescimento e produção de toxina por A. flavus. A colonização de milho por Fusarium spp tem sido claramente inibida por Aspergillus e Penicillium spp. a 250C, dependendo da atividade de água e da espécie testada. Porém, as interações que levam a uma redução na colonização por Fusarium não afetam negativamente a produção de fumonisinas.

Tentativas de controlar o crescimento de Botrytis cinérea em maçãs incluiu testes com Pseudomonas cepacia, Erwinia sp., Pichia guilliermondii, Cryptococcus sp., Acremonium breve e Trichoderma pseudokoningii, sendo que todos demonstraram ser efetivos. O mais efetivo foi Erwinia sp., especialmente em condições ambientais.

Regulamentação de micotoxinas no Brasil e no mundo

(http://www.cnpat.embrapa.br/cnpat/cd/jss/acervo/Dc_110.pdf) Legislações têm sido adotadas em muitos países com o intuito de proteger os consumidores contra os efeitos nocivos das micotoxinas em alimentos in natura e processados e, inclusive, em rações para animais de abate e de estimação. As legislações mais conhecidas são aquelas que regulamentam os níveis de aflatoxinas, não obstante legislações para outras micotoxinas estejam sendo também implementadas rapidamente. Existem diversos fatores que conduzem à elaboração dessas legislações. Por exemplo, existem os aspectos científicos, tais como a disponibilidade de informações toxicológicas, o conhecimento acerca da distribuição das micotoxinas nos alimentos, além da metodologia analítica. Também, devem ser considerados os aspectos políticos e econômicos, principalmente com relação aos interesses comerciais e aos impactos na disponibilidade da oferta de alimentos.

Informações coligidas demonstram que cerca de 100 países já dispõem de legislação para regulamentar os limites de micotoxinas em alimentos, rações e commodities. Os países cobertos por essas legislações englobam aproximadamente 90% da população mundial. Esse levantamento confirma que o aumento na população, agora protegida pelas legislações de micotoxinas, ocorreu graças a um pequeno aumento observado na América Latina e Europa, e a um significativo aumento na cobertura populacional na África e Ásia/Oceania (veja Figura 9 e 10). Ademais, todos os países que possuem legislação para micotoxinas têm, pelo menos, limites regulamentares para a presença de aflatoxina B1 ou para a soma B1+B2+G1+G3.

FIGURA 9 - PERCENTAGEM DA POPULAÇÃO GLOBAL COBERTA PELA LEGISLAÇÃO DE MICOTOXINAS EM 1995 (PDF – página 30) ( VEJA NO PDF )

Figura 10 - PERCENTAGEM DA POPULAÇÃO GLOBAL COBERTA PELA LEGISLAÇÃO DE MICOTOXINAS EM 2003 (PDF – página 30) ( VEJA NO PDF ABAIXO )

Entretanto, várias outras micotoxinas já estão também sob legislação. Dentre elas, destacam-se a aflatoxina M1, os tricotecenos desoxinivalenol, diacetoxiscirpenol, as toxinas T2 e HT2, as fumonisinas B1, B2 e B3, a ocratoxina A, a patulina, a esterigmatocistina, a zearalenona, os alcalóides ergóticos e, até mesmo, o ácido agárico e as fomopsinas. Tem-se observado que um maior número de micotoxinas encontra-se sob legislação, tendo-se elevado também o número de produtos e commodities analisados. Os limites de tolerância têm se mantido nos mesmos níveis ou têm mostrado uma tendência para decrescerem, enquanto que os métodos de amostragem e de análise têm se tornado mais diversificados e muito mais detalhados. Uma tendência extremamente interessante é a harmonização das legislações nos países pertencentes aos diferentes blocos econômicos, tais como Austrália/Nova Zelândia, Comunidade Européia e Mercosul.

Na maioria dos países africanos, onde não existe legislação em vigor, a população encontra-se exposta à contaminação com micotoxinas, principalmente com relação às culturas de subsistência, que são consumidas nas próprias áreas de produção ou nas suas vizinhanças. Os países africanos que possuem alguma legislação apenas as aflatoxinas são contempladas. Dentre os países daquele Continente, o Marrocos possui a legislação mais avançada. Com relação Ásia/Oceania cerca de 26 países possuem legislação para micotoxinas, representando 88% da população daquela região. A Nova Zelândia, entretanto, apresenta legislação própria, com algumas diferenças em relação à da Ásia e ao norte da Austrália. Atualmente, Austrália e Nova Zelândia estão harmonizando suas legislações que incluem limites para micotoxinas exóticas, tais como o ácido agárico e as fomopsinas. Nesses extensos continentes, as legislações da China e da República Islâmica do Irã são as mais completas e detalhadas.

No continente Europeu 39 países, representando 99% da população europeia, apresentam legislações para a regulação de micotoxinas em alimentos e rações. Comparada com outras regiões do mundo, a Europa dispõe da mais completa e detalhada legislação sobre micotoxinas em alimentos. Na comunidade européia já foram harmonizadas as legislações para aflatoxinas em vários alimentos, como para aflatoxina M1em leite, ocratoxina A em cereais e frutos desidratados, para patulina em suco de maçã e produtos derivados de maçã, e para aflatoxina B1 em várias rações. Ações preliminares já foram iniciadas com relação ao deoxinivalenol em cereais e em produtos derivados de cereais. Alguns países que ainda não fazem parte da comunidade européia possuem legislação ainda mais avançada que a própria comunidade.

Na América do Norte, os Estados Unidos e o Canadá possuem legislação para micotoxinas há muitos anos, e continuam aperfeiçoando os métodos de amostragem e análise. Nos dois países os limites para aflatoxinas são estabelecidos para a soma B1+B2+G1 e G2. No Canadá, além dos limites impostos para as toxinas fusarianas, existem também percentagens de tolerância para grãos danificados em espiguetas de trigo, tanto para o tipo mole quanto o tipo duro, além de limites para outros grãos. Existem, também, limites para a presença de esclerócios de Claviceps purpurea em várias culturas (é nos esclerócios onde se acumulam os alcalóides ergóticos). Nos Estados Unidos, existem detalhados limites de tolerância para a soma das fumonisinas B1, B2 e B3 em uma ampla variedade de produtos de milho. Esse é único país no mundo onde ocorrem limites para a soma dessas três fumonisinas.

Na América Latina, 19 países dispõem de legislação para micotoxinas, representando quase 91% da população continental. A legislação para aflatoxinas encontra-se harmonizada no Mercosul, englobando a Argentina, o Brasil, o Paraguai e o Uruguai. O Uruguai possui a mais detalhada legislação da América Latina, com limites para os alcalóides ergóticos em rações, o que é inédito em qualquer legislação no mundo.

No continente sul americano, a legislação cobre, especialmente, as seguintes micotoxinas, em alimentos e em algumas rações: aflatoxina B1, aflatoxinas B1/G1, aflatoxinas totais (B1+B2+G1+G2), fumonisina B1, desoxinivalenol, ocratoxina A, patulina e a zearalenona (veja Tabela 3).

TABELA 3 - LEGISLAÇÃO PARA MICOTOXINAS EM ALIMENTOS E RAÇÕES NOS DIFERENTES CONTINENTES ( VEJA NO PDF ABAIXO )




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